Tema 1. Extracción de tejido para análisis del ADN

PUNTO 1. TOMA DE LAS MUESTRAS EN EL CADÁVER

Un cadáver es la materia esencial para averiguar qué ha ocurrido previamente a la muerte. Así, cada muestra que pueda conseguirse será de gran utilidad para complementar la información lograda por la autopsia. Es por esto por lo que la observación del cadáver obtiene una relevancia suprema, llegando a niveles tan altos como el trato del mismo a modo de escena de un crimen, investigando cada una de las evidencias que pudieran surgir en torno al fallecimiento del sujeto.

En un cadáver es posible localizar indicios que pertenecen a su persona y otros que no. De esta forma, se puede distinguir entre biológicos y no biológicos. Los primeros serán enviados al laboratorio de biología, llegando incluso al laboratorio de genética forense para extraer el ADN e identificar a la víctima.

 

1.1. Recogida de indicios biológicos en el cuerpo de la victima

1.1.1. Indicios sólidos

• Semen, manchas de sangre y fluidos biológicos diferentes: la mancha ha de ser recogida con un hisopo estéril humedecido levemente con agua destilada. Higienizar toda la zona haciendo una mínima presión.
• Saliva en señales de mordiscos: coger la mancha con un hisopo estéril humedecido con agua destilada. Asear en círculos el espacio señalado por los dientes.
• Uñas: recoger todos los elementos insertos en manos y uñas del cadáver, intentando localizar todo el material biológico o no implantado en las mismas. Pelos o fibras son los ejemplos más comunes que tendrán que ser introducidos en pequeñas bolsas de plástico para proceder a su posterior análisis.
• Pelos dubitados: recoger con pinzas y clasificar cada selección por bolsas.

 

1.1.2. Indicios húmedos

• Ropas y objetos: son los materiales donde más fácilmente puedes encontrar estos indicios húmedos como por ejemplo la sangre. El procedimiento es dejar que se sequen para acabar recogiéndolas y metiéndolas en pequeñas bolsas para ser analizadas.

 

1.1.3. Indicios liquidos

• Sangre

– En poca cantidad: recoger con hisopo estéril.

– Coagulada: recoger con cuchara o tubo/frasco de plástico.

 

• Semen

– Procedimientos de muro: preservativos, capuchas, etc. han de conservarse y atarse correctamente para no derramar su contenido.

– Poca cantidad: recoger con hisopo estéril.

 

• Líquido amniótico

– Escoger muestra de 10 ml.

 

• Orina

– La pipeta desechable es la elección idónea para más tarde insertarlo en frascos o tubos y proceder a su estudio.

 

1.1.4. Restos fetales y placentarios

Han de ser sacados mediante pinzas y categorizados en botes con una boca ancha y que esta sea de rosca. Es muy importante que no haya ninguna fricción con líquido fijador.

 

1.2. Recogida de muestras indubitadas en el cadáver

Cada cadáver aporta unas muestras diferenciadas del anterior o del siguiente.

Por esto, la putrefacción del mismo y/o esqueletización será determinante.

• Cadáveres bien conservados: reservados naturalmente para evitar su desfiguración, estos han pasado pocas horas o días desde el momento de la muerte. Se han refrigerado las víctimas y no han sido exhibidas a agentes del medioambiente que pudieran avanzar la putrefacción del cadáver.
• Cadáveres en sus inicios de putrefacción: se pueden observar cambios en la víctima.
• Cadáveres con altos procesos de descomposición por agentes físicos o químicos: el ritmo habitual de esqueletización se ve variado, y acelerado, por diferentes productos.
• Cadáveres carbonizados: han sufrido ignición por fuego.

 

1.2.1. Muestras indubitadas en cadáveres en buen estado de conservación

Sangre post-mortem

Gracias a un tubo con anticoagulante EDTA podrá analizarse la muestra de sangre seleccionada y metida en el mismo (10 ml). Si se desea examinar de una forma diferente deberá escogerse otra muestra aparte.

 

Músculo esquelético

Se escogen dos trozos de músculo esquelético del espacio con mejor conservación, con unos 10 gramos de peso y 2 centímetros de lado y se adentra en un bote de boca ancho y tapón de rosca. Es el tejido más fuerte ante la putrefacción.

 

1.2.2. Muestras indubitadas en cadávares en avanzado estado de putrefacción o esqueletizados

En dichas circunstancias se recomienda la selección de la estructura ósea y dental (mínimo cuatro dientes para evitar la exhumación) que serán clasificados por separado gracias a las bolsas de papel antes detalladas. Las muestras tendrán que ser, después del estudio, limpiadas, especialmente si los huesos contienen una materia pultácea generada por la necrosis de los tejidos gangrenados denominada putrílago.

Las zonas de mejor conservación tendrán que ser almacenadas, ya sean tejidos o vísceras (el corazón es el que más aguante tiene ante la putefracción).

 

Huesos

Se higienizará el cadáver de la parte que contenga putrílago, escogiendo siempre que se pueda un hueso de gran extensión (fémur si es posible).

En caso de que no sea posible realizar el envío de la totalidad del fémur, es recomendable efectuar un corte en el mismo que abarque, al menos, unas dimensiones relativas a los 6×4 cm. La lijadora será el instrumento idóneo para hacer el corte ya que perjudicará en menor grado al material y no dañará el proceso de estudio antropológico.

 

Dientes

Tal y como se ha explicado antes, la selección de hasta cuatro dientes es el ejemplo más recomendado. Los molares son los preferidos, siendo más importante aún que los mismos no estén deteriorados ni hayan sufrido ningún tipo de endodoncia.

 

2.2.3. Muestras indubitadas en cadáveres carbonizados

En los casos en los que la ignición parece dificultar el análisis del cadáver será importante ser consciente que el examen de estas victimas sigue siendo posible a raíz de trozos de músculo esquelético o sangre semisólida que todavía está intacta en oquedades cardiacas de las mismas.

La distinción entre una carbonización pausada o acelerada es importante porque estaremos ante diferentes casos: en unos casos será posible estudiar el músculo esquelético o vísceras a pesar de la carbonización ya que encontraremos muestras sacadas de la cavidad medular de los huesos de mayor extensión, al ser estos los más protegidos en el acto combustible.

 

2.2.4. Muestras indubitadas en cadáveres conservados

Existen los procedimientos naturales y artificiales para conservar cadáveres. En el primer caso, encontramos la saponificación, momificación y congelación. En el segundo caso aparecen el embalsamamiento y la momificación artificial.

• Saponificación: se da la transformación de las grasas del cuerpo en ceras. Los cadáveres sufren una serie de grandes procedimientos de intercambio iónico, con una elevada degradación macromolecular, sobre todo en entornos muy húmedos. A pesar de que la imagen conservadora es elevada, el análisis de su ADN parece dificultoso.
• Momificación: al igual que la congelación, se trata de preservar el cuerpo ya muerto para desecar rápidamente el cuerpo y disminuir la temperatura del mismo. Así, se consigue frenar la putrefacción de la materia orgánica ya que no existe ninguna posibilidad de que crezcan bacterias en el mismo por la inexistencia de agua o prácticas biológicas en el organismo.
• Embalsamamiento: gracias a líquidos conservantes como el formol el ADN se degrada altamente haciendo muy complejo el examen, sin embargo, y en coordinación con el laboratorio, es posible estudiar el cuerpo dependiendo de la tipología o antigüedad del embalsamado.

 

2.3. Recogida de indicios biológicos en las pertenencias del fallecido

En gran parte de las casos serán los técnicos, aquellos que acompañan al forense, los encargos de desnudar al cadáver y observar en una primera toma cuáles son las evidencias más vistosas que puedan describir la causa.

 

2.3.1. Manchas secas en prendas de vestir u objetos pequeños y de fácil transporte

• Manchas de sangre, semen o diferentes fluidos biológicos en la ropa del cadáver.
• Chicles.
• Piedras, hojas, ramas.
• Joyería, artículos monetarios, cerrajería.

 

2.3.2. Manchas secas en muestras en prendas de vestir u objetos grandes de difícil transporte

• Soportes no absorbentes (como anoraks o prótesis):

– Frotar con hisopo estéril humedecido con agua destilada.

– Raspar la mancha con un bisturí encima de un papel doblada con precisión y siendo penetrado con cautela en una bolsa.

• Soportes absorbentes (como abrigos o mantas):

Lo ideal es seccionar la zona en la que está la mancha, dejando un margen entre la zona concreta y el espacio por el que se limita el corte para no perder parte de la muestra y tener una facilidad de análisis superior.

 

PUNTO 2. PROTECCIÓN DE LAS MUESTRAS

Desde el momento en que muera un sujeto hasta que se consigue su ADN, cada uno de los procedimientos que sucedan en su entorno y que puedan afectarle conllevarán a una bajada de la aglomeración de las macromoléculas que se degradarán con el tiempo.

Así, en los reconocidos fenómenos cadavéricos, cuando el cuerpo ya no tiene vida, se produce el perjuicio de las células del organismo, su composición y parte integrante. Por tanto, la calidad del ADN se verá reducida.

La autolisis, junto con la putrefacción bacteriana, es el mayor motivo de extravío de ácidos nucléicos en un cadáver preservado de consecuencias del medio ambiente. Otros procesos como la deshidratación o enfriamiento no alteran el ADN.

Son muchos los procesos que pueden alterar la integridad de una muestra.

Veamos cuáles son:

• Contaminación por material biológico humano: tiene que ver con el depósito de la víctima tras su muerte. No tiene por qué ser realizado por miembros de la propia investigación. Aquí, curiosos o familiares, desde el conocimiento, perjudican el mecanismo y comienzan la contaminación.
• Transferencia de indicios biológicos: está relacionado con el traspaso, habitualmente incidental. Suelen perderse partes de la muestra. Los pelos son la zona de mayor perjuicio.
• Contaminación microbiológica: este tipo de contaminación se da por el desarrollo de microorganismos y se favorece por la humedad y altas temperaturas.
• Contaminación química: existencia de elementos químicos que dificultarán el procedimiento del examen genético, especialmente la amplificación y extracción de ADN.

Estas son algunas recomendaciones para prevenir minimizar o evitar los procesos explicados anteriormente:

• Recluir y defender los indicios biológicos con rapidez.
• Emplear guantes higienizados, cambiándose habitualmente.
• No hablar o estornudar ante las muestras.
• Uso de batas o ropas que protejan.
• Emplear instrumentos desechables.
• No introducir conservantes sobre las muestras.
• Meter en paquetes aislados cada muestra.
• Evitar el plástico en el empaquetado.
• Tirar todo el material desechable usada cuando finalice.
• Permitir la deshidratación del cadáver con la temperatura ambiental.

 

PUNTO 3. SISTEMAS DE EMPAQUETADO Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS

Como ya se ha explicado, para conservar la integridad de las muestras y del ADN el empaquetado ha ser de usado con total rigor. Por esto, es totalmente necesario que cada uno de los recipientes usados (bolsas, tubos, cajas, etc.) se identifiquen correctamente acerca de su contenido y se precinten para mantener a salvo su contenido.

 

3.1. Identificación de las muestras

En esta identificación ha de aparecer:

• Número de referencia de la muestra.
• Clase de muestra.
• Ubicación y pertenencia.

 

3.2. Cadena de custodia

• Nombre o forma de identificar (firma) a la persona que recogió la muestra.
• Datación de la recogida.

 

3.3. Sistemas de empaquetado

Cada uno de los mecanismos expuestos a continuación finalizará con el envío al laboratorio sin refrigerar, exceptuando los dos primeros casos y los huesos.

También será necesaria su identificación.

• Tubos con indicios líquidos: se penetrarán en tubos de transporte con oclusión hermética.
• Frascos o boles con indicios líquidos u órganos, tegumentos reblandecidos, etc.: cierre de rosca o hermético y con precintado.
• Hisopos estériles deshidratados: empaquetados en cajas de cartón con finalidad comercial.
• Muestras con manchas deshidratadas: se colocará cada muestra en un papel doblado e insertado correctamente en una bolsa de papel con precinto.
• Pelos debitados: idéntico proceso al anterior.
• Uñas, costras, raspaduras: igual manera que con los pelos debitados.
• Dientes y estructura ósea: serán adentrados en bolsas de papel o cajas de cartón que se adecuen a sus dimensiones. Los huesos con sobras de putrílago se meterán en recipientes de plástico con obturación hermética.

 

PUNTO 4. DOCUMENTACIÓN

4.1. Documentación precisa

Formulario de envío de muestras:

• Investigación demandada.
• Antecedentes e información sobre la víctima.

– Motivos.

– Ubicación.

– Datación.

– Instrumento usado para provocar la muerte.

• Información del fallecido.

– Edad cuando falleció.

– Fecha del fallecimiento.

– Conservación.

– Tiempo que ha pasado desde la muerte.

– Sexo.

– Población.

– Motivo de la muerte.

– Lesiones.

– Relación con el sospechoso.

• Información de los sospechosos.

– Edad.

– Sexo.

– Población.

– Lesiones, hendiduras, etc.

• Identificar las muestras.
• Lista de muestras por referencia.

– Número de referencia.

– Clase de muestra (sangre, saliva, pelos, etc.).

– Código o nombre del fallecido.

– Relación con el caso (muerto, sospechoso, etc.).

• Lista de indicios biológicos.

– Número de referencia.

– Clase de muestra identificada y explicada brevemente.

– Zona en la que apareció (encima de la camiseta, boca, etc.).

– Estudio exacto en que debe clasificarse (semen, saliva, etc.).

• Cadena de custodia.

– Nombre, identificación y firma de las personas encargadas de recoger las pruebas.

-Datación y horario en el que se efectuó la recogida.

– Formas en que se almacena la muestra hasta llegar al laboratorio.

 

4.2. Documentación recomendable

• Informe precedente a la autopsia.
• Informe clínico.
• Información de inspección ocular.
• Documentos complementarios sobre la zona en la que se encontraron las pruebas o indicios biológicos.
• Imágenes de los indicios biológicos obtenidas antes de la recolección de los cadáveres.

 

PUNTO 5. PRECAUCIONES EN LA TOMA Y EMBALAJE DE LAS MUESTRAS

El principal cuidado en el tratamiento de cadáveres está a la hora de prevenir infecciones. A pesar de que algunas, sobre todo las de origen vírico, se atenúan o pierden capacidad en los cadáveres, hay otras que con el contacto humano o mediante fluidos puede ser transmitida.

Es importante tener en cuenta que gran parte de los individuos que trabajan en este sector pueden convertir en asintomáticos y convertirse en infectantes para el resto de personas con las que se rodean en su entorno personal. Es por esto por lo que las precauciones siempre son pocas y la exposición ante cadáveres ha de tomarse con el rigor pertinente.

 

5.1. Fluidos corporales de alto riesgo

Aplicados en sangre y cualquier fluido que posea sangre observable. El semen, las secreciones, leche materna y cualquier líquido que provenga de alguna oquedad humana entran en este apartado. Tienen un alto peligro porque son la fuente de virus y otros agentes transmitidos parenteralmente.

 

5.2. Fluidos corporales de bajo riesgo

Aplicado en deposiciones, secreciones nasales, transpiración, lágrimas, orina, vómitos, jugos gástricos o expectoración. No transmiten virus de hepatitis B o VIH pero sí hay peligro de traspasar infecciones bacterianas en el contacto con la piel y mucosas de la persona operante.

 

5.3. Precauciones en la toma de muestras en la sala de autopsias

Cada uno de los instrumentos especificados a continuación ha de emplearse en la totalidad del proceso.

• Guantes.
• Mascarillas.
• Gafas defensoras.
• Delantal impermeable.

 

5.4. Precauciones en el embalaje de las muestras

• Guantes.
• Mascarillas.
• Gafas defensoras.
• Higiene del instrumental.

 

PUNTO 6. TOMA DE MUESTRAS DE REFERENCIA

No es habitual que este tipo de muestras sean seleccionadas paralelamente a las muestras del fallecido. Estas muestras serán recogidas en la zona y ubicación estipuladas por las autoridades correspondientes, mediante un documento de autorización expreso cediendo la muestra para su posterior examen genético.

 

6.1. Familiares más adecuados para la identificación

• Ascendientes y descendientes directos.
• Padre y madre biológicos.
• Cónyuge e hijos del muerto.
• Hermanos del cadáver.
• Otros miembros de la familia.

 

6.2. Clases de muestras

6.2.1. Muestras indubitadas en personas vivas

La sangre es la muestra indubitada tradicional usada para obtener el ADN. Se puede lograr mediante:

• Punción venosa. Muestra de unos 5 ml de sangre que se insertan en un tubo con anticoagulante clase EDTA.
• Punción dactilar. Se realiza un pinchazo en la cara anterior de un dedo cualquiera. Lo habitual es conseguir 3 o 4 gotas de sangre y permitir su deshidratación con la temperatura del medio ambiente en una zona que esté defendida.

Las células epiteliales bucales (saliva) se consiguen con el frotado de la zona interior de los carrillos mediante hisopos estériles deshidratados. Se hace a través de dos tomas. En primer lugar con un hisopo se rasga la zona interna del carrillo derecho y con la otra cara la del carrillo opuesto. Finalmente se permite su secado en una zona en defensa.

Es posible además usar cepillos cónicos para conseguir muestras endocervicales. Para la consecución de estas tomas es importante que haya pasado una hora al menos desde la última ingesta, evitando así la aparición en las muestras de sobras de alimentos. Si no es posible esta espera se debe enjuagar la zona previamente.

• Pelos con raíz. Entre 10 y 15 pelos de esta tipología.

 

6.2.2. Otras muestras de referencia en personas muertas

Cuando no se pueda exhumar un fallecido para obtener muestras y no haya nadie que pueda identificar al muerto se puede:

• Analizar los restos biológicos del cadáver en centros hospitalarios.
• Investigar muestras de sangre, biopsias, etc. del muerto que sea posible que sigan en los hospitales. No se recomienda el estudio de tejidos sujetos en formol.
• Estudiar restos biológicos del cadáver que todavía estén en el entorno familiar (peines, sobres, maquinillas de afeitar, etc.).

 

PUNTO 7. CADÁVERES CON INDICIOS DE TRANSFUSIÓN Y/O TRASPLANTE

En caso de que un sujeto haya recibido una transfusión de sangre será más compleja la identificación de la persona ya que en el contenido de la misma aparecerán dos perfiles, el del donante y el del receptor.

Esta hibridación será existente en el resto de órganos que posean mayor irrigación. Por esto, la saliva o los pelos con raíz se convierten en las muestras de mayor determinación en estos casos.

En cuanto a los órganos donados existe una igualdad con el caso anterior. Las células de dichos órganos pertenecerán al donante por lo que no se recomienda el envío al laboratorio de estas muestras.

 

8. CADÁVERES PROCEDENTES DE GRANDES CATÁSTROFES

Cuando ocurre una gran catástrofe, donde los cadáveres se mezclan e incluso acaban fragmentándose, es importante recoger muestras con la intención de identificarlas y permitir la realización de manera metódica de investigación de reasociación de restos humanos y cadáveres.

Los análisis de ADN en casos con una gran cantidad de fallecimientos se basan en la comparación analítica entre los perfiles conseguidos gracias a:

• Consecución de muestras post-mortem.
• Consecución de muestras ante-mortem y de familiares para identificar al cadáver.

 

8.1. Recogida de muestras para análisis de ADN

Esta recogida de muestras puede conseguirse en diferentes escenarios dependiendo de la clase de la misma que se precise:

• Área de depósito de los cuerpos de las víctimas.
• Centro de asistencia a los familiares.
• Localización del accidente.

 

8.1.1. Restos humanos

La dificultad en la asimilación de las muestras dependerá de la cantidad de fallecidos, la fragmentación de los cuerpos y la conservación de estos. Sin embargo, es importante intentar lograr muestras para analizar el ADN de cada uno para poder reasociar los restos y poder elaborar estudios más amplios.

 

Identificación de las muestras

Es precisa la identificación total de los fallecidos con un procedimiento exclusivo y simple que eluda cualquier tipo de equivocación.

Este mecanismo estará compuesto por la identificación del cadáver en el levantamiento y en el IML (Instituto de Medicina Legal). Es posible que se necesiten varias muestras de un mismo cuerpo, entonces se asignará un número correlativo a cada una:

• Número levantamiento / Número IML / Número muestra ADN.

 

Documentación y material gráfico

• Se sacarán imágenes o documentación gráfica de los cuerpos antes de conseguir las muestras.
• Se cumplimentará un formulario-tipo para explicar el cadáver y la muestra seleccionada con descripciones cortas.
• Recoger más de una muestra si es preciso.
• Se rellenará la cadena de custodia.

 

Equipo de recogida y manejo de muestras

La recogida de muestras tiene que efectuarse en el momento de la autopsia o después.

Las precauciones tomadas por el equipo han de ser muy altas con la intención de impedir o dejar en los límites más pequeños el peligro de infección, ya sea por vía exógena o por proceso cruzado. Es importante, por tanto, el uso de ropa de protección e instrumento esterilizado.

 

Clase de muestras más idóneas para el estudio genético

Las más habituales son, siempre que no esté el cuerpo en estado de putrefacción (aquí se procederá a la recogida de dientes, uñas o huesos):

• Piel.
• Sangre.
• Trozos de órganos.
• Músculo esquelético.

 

8.1.2. Muestras de referencia de familiares

Identificación de las muestras

De igual modo que con los restos humanos, se ha de seguir un procedimiento único y simple que haga del mecanismo un acto inalterable.

 

Documentación

• Será usado un formulario estándar.
• Se corroborará la información del donante con su DNI o pasaporte.
• Se redactará claramente la relación entre fallecido y familiar.
• Se rellenará la cadena de custodia.

 

Equipo de recogida y manejo de las muestras

Ha de estar compuesto por personas formadas y adiestradas para dar información a los familiares, con todo el tacto que se pueda, explicando cómo y para qué se van a utilizar las muestras, la clase de estudio que se va a efectuar, la duración que se estima, además de elegir al donante familiar que más se adecue, siempre que sea posible, a las características del caso.

Todo este proceso deberá ser guiado con el uso de guantes y material de protección de la victima, el donante y el operador.

 

PUNTO 9. CADÁVERES CON INDICIO DE HABER SUFRIDO AGRESIONES SEXUALES

9.1. Documentación necesaria

Para conocer el caso y proceder al estudio del forense tendrá que rellenar un formulario específico para estos casos. Este documento constará de una serie de apartados que veremos a continuación:

Formulario de envío de muestras para agresiones sexuales

• Información del fallecido:

– Edad.

– Sexo.

– Población.

– Empleo de productos para el coito.

– Comprobar si continua con la misma ropa de la agresión.

– Visualizar si se ha higienizado antes de ser reconocido.

– Información relativa al reconocimiento ginecológico.

– Relaciones sexuales cercanas a la agresión (datación, ubicación, etc.).

• Información de la agresión.

– Zona en la que ocurrió el desastre.

– Horario y día.

– Período desde que ocurre hasta que se recoge el cuerpo.

– Clase de agresión.

– Tipo de penetración.

– Introducción de objetos.

– De otra clase: cunnilingus, fricción corporal, etc.

– Cantidad de agresores.

– Relación entre agresor y cadáver.

– Empleo o no de preservativos.

– Eyaculación efectiva o no, en el interior o exterior.

• Información de la cadena de custodia.

 

9.2. Recogida de indicios biológicos

Estos indicios biológicos serán recogidos dependiendo de los antecedentes de

la víctima o la información que pueda aportar la misma. Será preciso hacer esa

recogida de la siguiente forma:

• Dos tomas bucales.
• Superficie corporal. Localizar manchas, saliva, mordiscos, etc.
• Recoger pelos dubitados.
• Dos tomas cervicales, vaginales y una genital externa.
• Higienizado vaginal mediante 10 ml de suero fisiológico estéril.
• Dos tomas anales y una del margen anal.
• Recolección de las ropas que vestía el cadáver en la agresión.

 

9.3. Recogida de muestras indubitadas

• Muestras habituales de la víctima más 10-15 vellos púbicos.
• Muestras del sospechoso.